Российские учёные впервые в мире смогли без ошибок прочесть иммуном человека

• 
• Михаил_Шугай

Михаил Шугай

Результаты масштабных исследований по расшифровке иммунома человка оказались более чем успешными, и их в июне опубликовал журнал Nature Methods. Это одна из 6 статей с участием российских учёных, вышедших в июне в журналах издательства Nature Publishing Group.

Разнообразие иммунных клеток у человека с возрастом заметно меняется. У детей на миллион клеток, взятых из крови, приходится около 700 тысяч уникальных вариантов, а у стариков – около 300 тысяч, поэтому их иммунная система слабее. Однако до недавнего времени отследить эти изменения в разнообразии клеток, связанные со старением и восприимчивостью к заболеваниям, было не так просто. При расшифровке иммунома (набор всех последовательностей иммунных рецепторов, которые встречаются у отдельно взятого человека; он включает в себя последовательности рецепторов Т-клеток (киллеров), распознающих инфицированные клетки, и последовательности антител, которые производят Б-клетки) учёные сталкивались с огромным количеством ошибок, создающих «пёструю» картину иммунитета и тем самым искажающих подлинный иммунный статус человека.

С подобными ошибками столкнулись и учёные Института биоорганической химии РАН при работе над крупным проектом, посвящённым анализу возрастных и вызванных химиотерапией или облучением изменений в иммунитете. Прежде чем браться за проект всерьёз, они решили разработать собственную технологию эффективного вычищения ошибок и потратили на это около трёх лет.

Зато результаты оказались более чем успешными, и их в июне опубликовал журнал Nature Methods. Это одна из 6 статей с участием российских учёных, вышедших в июне в журналах издательства Nature Publishing Group.

Уровень шума растёт

В иммуноме записана вся информация о нынешних и прошлых заболеваниях человека, и именно его анализ может раскрыть причину возникновения, к примеру, практически не изученных аутоиммунных заболеваний.

Работа с секвенированием иммунома предполагает некоторые сложности, из-за которых и возникают ошибки. Для чтения информации используется технология высокопроизводительного секвенирования, которая позволяет одновременно получать последовательности сотен миллионов коротких молекул ДНК. «При любом чтении генома, транскриптома или иммунома мы стартуем с небольшого количества материала, – рассказал Михаил Шугай, первый автор исследования, выпускник физфака МГУ и сотрудник лаборатории геномики адаптивного иммунитета ИБХ РАН (под руководством Дмитрия Чудакова). – Фрагментов молекул ДНК мало, поэтому чтобы достоверно их прочитать нужно их сперва амплифицировать. Для этой цели применяется полимеразная цепная реакция, ПЦР. Это первая часть работы – то, что называется подготовкой библиотеки».

По словам молодого учёного, уже на этом этапе копирование-размножение молекул вносит массу ошибок: «Под ошибкой я имею в виду неправильно прочтённую букву ДНК – когда прочитался один нуклеотид, в то время как на его месте должен быть другой». Циклов амплификации происходит много, молекул тоже много, и ошибки при копировании становятся воспроизводимыми, повторяющимися. Есть и ошибки самого прочтения прибором, когда флуоресцентный сигнал прибора указывает на неверную букву той или иной молекулы. Таким образом с увеличением количества получаемой информации растёт и уровень шума, то есть ошибочно прочтённых букв. А ведь изменение даже одной буквы в последовательности иммунного рецептора способно полностью изменить его специфичность.

Элегантная работа над ошибками

Как рассказал Михаил, большая часть ошибок, возникающих при анализе данных секвенирования экзома (набора всех кодирующих последовательностей генома), может быть исправлена ещё на уровне обработки данных, но все подобные методики плохо применимы к иммуному по двум причинам. Одна из них связана с тем, что технологии рассчитаны на использование эталонных последовательностей, которых нет у иммунных рецепторов: «В их последовательностях присутствует гипервариабельный участок со сложным названием complimentarity determining region 3 (CDR3), который кодирует всю их специфичность, – пояснил ученый. – В теории существует около 10¹⁵ – 10²⁰ возможных вариантов последовательности CDR3.

Это значит, что для пары таких последовательностей практически невозможно сказать, являются ли они обе реальными вариантами или один из них возник в результате ошибок прочтения».

Работать с рецепторами Б-клеток ещё сложнее, поскольку в организме они постоянно эволюционируют путём увеличенного темпа мутаций и селекции по антиген-специфичности (так называемый процесс соматической гипермутации): «Во время работы мы поняли, что абсолютно никак не можем достоверно читать Б-клетки и распознавать, где гипермутация, а где ошибка», – подытожил молодой учёный.

Проблему с ошибками при чтении иммунома в ИБХ РАН «элегантно решили» с помощью технологии молекулярного баркодирования. «Эта технология уже была, и её применяли для подчищения ошибок при секвенировании экзома, – отметил Михаил. – Но, во-первых, мы применили её к иммунному репертуару, а во-вторых, усовершенствовали, разработав хитрый алгоритм, который дочищает почти все ошибки».

Согласно методу, который используют в научной группе Михаила, перед самым первым циклом амплификации региона, содержащего Т-клеточный или Б-клеточный рецептор, к каждой молекуле пришивают «хвостик» – уникальную метку со случайными нуклеотидами. «Это могут быть 12–14 абсолютно случайных нуклеотидов, – пояснил учёный. – Поэтому если в конце работы мы прочитаем “хвостики” с двумя разными последовательностями, то будем уверены, что это были разные молекулы. А если с одной и той же, то велика вероятность, что это одна и та же молекула». «Хвостики» выступают как маркёры, которые уникально метят каждую молекулу, а затем учёные могут благодаря ним группировать молекулы и подчищать ошибки: без таких маркёров неправильные варианты могли бы считаться правильными и не группировались бы.

«Мы позаботились наладить весь протокол так, чтобы можно было нормально сгруппировать все прочтения по баркодам, а потом ещё и удалить ошибки, возникающие на первых циклах, – сказал Шугай. – Так мы добились почти полностью безошибочного прочтения иммунома без потери его реального разнообразия».

Благодаря двум этапам зачистки ошибок (первая – группировка, вторая – фильтрация на основании того, что ошибка постоянно корректируется), их количество свелось практически к нулю.

• 
• Визуализация_зачистки_от_ошибок

Визуализация зачистки от ошибок (слева направо: сырые данные, первая часть коррекции, вторая часть коррекции)

Первый этап группировки последовательностей уменьшает темп ошибок в 10–100 раз, а финальная фильтрация способна уменьшить темп и в 1000 раз по сравнению с изначальным.

«В нашей работе у нас был набор из 12 клонотипов, контрольных последовательностей, и только в одной из них после всех зачисток осталось две ошибки, – рассказал учёный. – При этом если проводить базовую фильтрацию ошибок, то их окажется сотни – тысячи».

Компьютерный метод для онкологии и не только

Теперь учёные могут эффективно исследовать, как меняется иммунный репертуар в связи со старением, у пациентов, прошедших химиотерапию или вакцинацию, а также у таких интересных малоизученных групп пациентов, как ликвидаторы аварии на ЧАЭС.

Всё это поможет разработке эффективных методов мониторинга иммунного статуса, улучшению методов вакцинации и совершенствованию методик противоопухолевой иммунотерапии.

Онкологический проект, над которым Михаил сейчас вёдет работу в составе группы из РНИМУ под руководством профессора Сергея Лукьянова, направлен на поиск редких мутаций в крови. Учёным во время исследований важно «поймать» редкий подвариант, что критично для ранней диагностики опухолей и мониторинга рецидива. А поскольку он редкий, его частота небольшая, и его легко спутать с ошибкой. Здесь и находит применение метод, изначально разработанный для анализа иммунома.

Разработанный в стенах ИБХ РАН подход универсален и может быть использован и в ряде других областей, где применяется технология высокопроизводительного секвенирования. Сами учёные уже успешно опробовали его при секвенировании экзомов для поиска редких мутаций у онкопациентов и уверены, что при секвенировании микробиомов он позволит дать точную оценку разнообразия микроорганизмов в образце. «Сейчас мы хотим сделать унифицированный протокол и компьютерное приложение для обработки данных и для всех возможных экспериментов, в которых “пришиваются” эти нуклеотидные метки, – поделился планами на будущее Михаил. – Он будет включать в себя уже упомянутые Б-клетки и Т-клетки иммунома, метагеном, секвенирование экзома, поиск онкомутаций и унифицированную модель обсчёта этих данных».

Ясиновская Елизавета

Кстати, а вы знали, что на «Сделано у нас» статьи публикуют посетители, такие же как и вы? И никакой премодерации, согласований и разрешений! Любой может добавить новость. А лучшие попадут в телеграмм @sdelanounas_ru. Подробнее о том как работает наш сайт здесь👈